Espectroscopia de desactivación electromagnética del coronavirus humano 229E

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 8886 (2023) Citar este artículo

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Se logra una investigación de la desactivación de patógenos utilizando ondas electromagnéticas en la región de microondas del espectro utilizando estructuras de guía de ondas hechas a medida. Las guías de ondas cuentan con rejillas de longitud de onda inferior para permitir la integración de un sistema de refrigeración por aire sin alterar los campos de propagación internos. Las guías de ondas son cónicas para acomodar internamente una muestra experimental con suficiente flujo de aire circundante. La metodología propuesta permite un control preciso sobre las densidades de potencia debido al modo fundamental bien definido excitado en cada guía de onda, además del control de la temperatura de la muestra debido a la exposición a las microondas a lo largo del tiempo. El coronavirus humano (HCoV-229E) se investiga en el rango de 0 a 40 GHz, donde se observa una reducción viral máxima de 3 log en la subbanda de 15,0 a 19,5 GHz. Concluimos que HCoV-229E tiene una resonancia intrínseca en este rango, donde el daño estructural no térmico es óptimo a través del efecto de transferencia de energía resonante de la estructura.

La desactivación de patógenos mediante ondas electromagnéticas (EM) en la banda de microondas está atrayendo un creciente interés de investigación1,2,3,4,5,6,7,8,9. La naturaleza sin contacto de la desactivación de microondas es una característica que hace que el método sea particularmente útil en el contexto de las crisis de salud pública causadas por la reciente y actual pandemia de SARS-CoV-2. Las microondas pueden desactivar un virión de dos formas: mediante calentamiento térmico o mediante un proceso conocido como transferencia de energía estructural-resonante (SRET). Este último se basa en la idea de que los virus envueltos con geometrías esféricas simples resonarán en presencia de una onda EM2,3,4,5. Maximizar la amplitud de las vibraciones acústicas excitadas dentro de un virus esférico es importante para provocar el mayor desplazamiento y tensión en la estructura de la envoltura, lo que eventualmente puede provocar su ruptura. Los modelos actuales de vibraciones acústicas en modo dipolar en virus esféricos predicen que la mayor tensión aplicada por ondas EM de igual intensidad ocurre en el régimen de microondas2,4,10, lo cual está respaldado por un creciente cuerpo de evidencia experimental2,3,5. La desactivación del virus de la influenza A (H3N2) se ha demostrado utilizando microondas de baja densidad de potencia, en las que la membrana del virus se rompe mediante el efecto SRET2. En ese estudio, una solución viral registró una reducción de 3 log del virus activo después de 15 minutos de iluminación de microondas desde una antena de bocina que operaba a 8,2 GHz. La aplicación del efecto SRET es un medio no térmico prometedor para desactivar patógenos dañinos con resonancias intrínsecas en el régimen de microondas debido a las bajas densidades de potencia requeridas sugeridas2,3,4.

La esterilización por microondas de baja potencia y sin calentamiento requiere conocimiento de la resonancia natural intrínseca del virión para poder transferir de manera más eficiente la mayor cantidad de energía limitada disponible. Estudiar experimentalmente la espectroscopia de absorción de microondas de un virus es un desafío técnico, principalmente debido a la sensibilidad necesaria para detectar y distinguir razonablemente una respuesta atribuida a partículas de pequeño tamaño. Los métodos propuestos han involucrado líneas de transmisión de microondas en las que se introducen pequeños volúmenes de solución para perturbar las microondas guiadas dentro de la estructura2,3,5,8. Primero se mide el sensor solo con el fluido portador como referencia y luego se realiza una medición que contiene cierta concentración de virus. Luego se hace una comparación relativa para identificar los regímenes en los que se pierde más potencia de microondas, lo que indica la absorción por parte del virus. Esta metodología se ha utilizado para identificar resonancias de absorción de microondas del SARS-CoV-23, la influenza A (H3N2)2 y el virus del síndrome de la mancha blanca8.

En este informe, presentamos una nueva metodología de temperatura controlada para estudiar las interacciones electromagnéticas con patógenos. El coronavirus humano HCoV-229E (229E) se selecciona para utilizarlo como modelo de bioseguridad sustituto para coronavirus más altamente patógenos. Su geometría esférica y su disposición de proteínas de pico son representativas de muchos virus envueltos. Nuestra metodología se demuestra estudiando la desactivación basada en SRET de 229E que cubre 0,8 a 40 GHz e identificando una resonancia intrínseca dentro del régimen de 15,0 a 19,5 GHz. Dentro de este régimen, se observó una reducción de 3 log del virus activo después de sólo 7,5 minutos de exposición al microondas. Se utilizan guías de ondas rectangulares que están diseñadas para acomodar una muestra internamente, exponiendo la muestra a campos eléctricos bien definidos. Esto posee la ventaja clave de tener un control preciso sobre la intensidad del campo y la densidad de potencia expuesta a la muestra experimental. Se introducen rejillas de longitud de onda inferior en las paredes de la guía de ondas para integrar un sistema de enfriamiento del flujo de aire sin alterar los campos de propagación. Durante los experimentos, las muestras virales se enfrían continuamente para brindar confianza de que cualquier desactivación observada se atribuye a las vibraciones acústicas inducidas por SRET, en lugar del calentamiento excesivo por microondas de la solución portadora. Utilizando esta metodología, los virus se pueden estudiar bajo diferentes criterios de densidad de potencia y tiempo, de modo que se puedan determinar los regímenes de frecuencia óptimos y el grado esperado de desactivación de virus. Esta información es fundamental para el desarrollo de nuevas tecnologías basadas en microondas para el control de la transmisión, la esterilización y los tratamientos clínicos.

Para irradiar uniformemente las muestras virales mientras se controla la temperatura, se diseñó una serie de guías de ondas para dirigir la potencia de radiofrecuencia (RF) hacia la muestra y también permitir que el aire fluya más allá de la muestra para mantener la temperatura. Estas guías de ondas se diseñaron para irradiar muestras en un ancho de banda lo más amplio posible mientras operaban en el modo fundamental, utilizando lanzadores de guías de ondas comerciales cuando fuera posible. Esto impuso el uso de muchas bandas de guías de ondas para cubrir una gran franja de espectro, como se muestra en la Tabla 1. La Tabla 1 muestra las dimensiones de la guía de ondas de alimentación (a y b), así como las dimensiones de la guía de ondas donde se ubicó el tubo ( \(a_{tubo}\) y \(b_{tubo}\)). En la Fig. 1 se muestra un ejemplo de estas dimensiones. Esta imagen se generó a partir del modelo CAD (diseño asistido por computadora) utilizado para diseñar las guías de ondas. Todo el trabajo mecánico de CAD se completó en Dassault Systems Solidworks 2021.

En todos los casos se utilizaron lanzadores coaxiales a guías de ondas, excepto en la banda inferior (0,8–1,8 GHz), donde se diseñó una alimentación de sonda de guía de ondas de placa de circuito impreso (PCB) en una guía de ondas de altura reducida. Todos los tubos de ensayo se llenaron con \(600~\mu l\) de fluido y se ubicaron en el centro de la guía de ondas, con el fluido colocado en el centro de la sección transversal de la guía de ondas para maximizar la exposición de la muestra a la campo electromagnetico. En frecuencias más altas, esto requería expandir \(a_{tube}\) y \(b_{tube}\) en relación con a y b para encajar completamente la muestra viral en la guía de ondas y dejar espacio entre el tubo de ensayo y las paredes del Guía de ondas para enfriamiento.

(a) Vista superior y (b) lateral de un sensor de guía de ondas que muestra las dimensiones de la alimentación (ayb) y las dimensiones de la guía de ondas alrededor del tubo de ensayo. Imagen generada a partir del modelo CAD de las guías de onda diseñadas en Dassault Systemes Solidworks (Versión 2021).

Las muestras de los tubos de ensayo se enfrían forzando el aire a través de la guía de ondas y pasando por el tubo de muestra. Esto se logró utilizando ventiladores como se muestra en la Fig. 2 que forzaron el aire a través de rejillas en el costado de la guía de ondas, pasaron la muestra y salieron a través de un conducto de escape. Estas rejillas fueron metalizadas y diseñadas para tener orificios lo suficientemente grandes como para permitir el flujo de aire, pero lo suficientemente pequeños en relación con la longitud de onda de la señal para contener la mayor parte de la energía de RF dentro de la guía de ondas.

Montaje general del sensor de guía de ondas. Imagen generada a partir del modelo CAD de las guías de onda diseñadas en Dassault Systemes Solidworks (Versión 2021). Los modelos para los lanzadores WR90 se proporcionaron de forma gratuita a partir del 11.

Las guías de ondas se imprimieron en 3D mediante modelado por deposición fundida (FDM) a partir de ácido poliláctico (PLA) y se metalizaron con cinta de aluminio. Esta técnica es conveniente para la creación rápida de prototipos de piezas de guías de ondas con un rendimiento equivalente al de los componentes totalmente metálicos 12,13. Este método se utilizó para ensamblar cada una de las bandas de guía de ondas que se muestran en la Tabla 1, excepto la banda más baja. Por debajo de 1,8 GHz, la guía de ondas se implementó doblando láminas de metal para formar las paredes y se imprimió en 3D un marco de andamio para mantener unidas las láminas de metal. Como se señaló anteriormente, esta guía de ondas se alimentó mediante una sonda de PCB. En la Fig. 3 se muestran imágenes de muestra de las guías de ondas ensambladas. Las estructuras de las guías de ondas se simularon utilizando un solucionador de elementos finitos de onda completa (ANSYS HFSS) para determinar las intensidades de campo en el centro del tubo de muestra viral. La potencia de entrada se estableció en 2 vatios y se realizaron simulaciones para el caso de un tubo vacío lleno de aire y el caso de un tubo lleno con el modelo dieléctrico para la solución portadora viral. Las intensidades de campo simuladas se muestran en la Fig. 4. Las intensidades de campo para el tubo de ensayo lleno de líquido en comparación con el tubo de ensayo lleno de aire (especialmente a frecuencias más altas) se deben al aumento de \(\epsilon _r\) de la solución portadora. con frecuencia en comparación con el aire.

Imágenes de los componentes de la guía de ondas ensamblados y el amplificador de potencia utilizados para completar los experimentos de desactivación viral; cada una de las guías de onda fue diseñada e impresa por el grupo, y el grupo ensambló el amplificador utilizando componentes disponibles en el mercado.

Intensidades de campo simuladas en el centro del tubo de ensayo cuando el tubo de ensayo se llenó con (a) aire o (b) medio con suero reducido.

La permitividad compleja proporciona una descripción EM armónica de tiempo completa de un medio. La permitividad compleja del medio de suero reducido (OptiMEM) sin ningún virus se caracteriza utilizando el método de sonda coaxial de extremo abierto. Se genera un modelo dependiente de la frecuencia utilizando una metodología desarrollada previamente14 y se muestra en la Fig. 5 junto con agua desionizada (DI) como referencia. La alta constante dieléctrica del medio de suero reducido puede provocar reflexiones significativas dentro de la guía de ondas llena de aire y, si no se tiene en cuenta en el diseño, la coincidencia de entrada de las guías de ondas experimentales podría degradarse gravemente. Por esta razón, el modelo de permitividad se integra dentro de las herramientas de simulación EM para ayudar a diseñar, sintonizar y evaluar estructuras de guías de ondas de modo que se logre un alto rendimiento de RF en los casos experimentales que contienen muestras. Dado que la concentración viral en las muestras es baja, se asumió que habría un impacto mínimo en las propiedades dieléctricas del medio con suero reducido, independientemente de la presencia del virus.

Modelo dieléctrico de medio de suero reducido comparado con agua desionizada (DI).

La energía de microondas absorbida por muestras experimentales provoca tanto calentamiento como alteraciones en la estructura del virus. Sin un sistema de enfriamiento para eliminar el exceso de calor, la temperatura del virus podría alcanzar criterios suficientes para que se observara una reducción relacionada con el calor. El calentamiento de un medio con suero reducido debido a la exposición a microondas durante los procedimientos experimentales se caracteriza para verificar que el sistema de enfriamiento integrado sea capaz de eliminar suficientemente el exceso de calor y garantizar que cualquier desactivación viral observada no se atribuya al calor. Específicamente, en todos los experimentos la temperatura del virus no debe exceder los 44 \(^\circ\)C, ya que se esperaría cierto grado de desactivación del HCoV-229E relacionada con el calor. Se sabe que otros coronavirus muestran inactivación cuando se calientan en el rango de \(44^\circ C-65^\circ C\) en escalas de tiempo cortas comparables (< 15 minutos) a las utilizadas en este trabajo15. Se observa cierta variación en el calentamiento de la muestra experimental en todo el espectro investigado en este estudio. Aunque la potencia de entrada es constante para todos los casos experimentales, la variación de las dimensiones de la guía de ondas varía la densidad de potencia de las ondas guiadas, además de alterar el espacio que rodea la muestra para que fluya el aire. Además, las propiedades dieléctricas del medio de suero reducido varían con la frecuencia, es decir, la tangente de pérdida, que influye en la fracción de potencia absorbida por el medio. Por estos motivos, la caracterización del calentamiento de la muestra debe realizarse en todos los casos individualmente para verificar que la muestra esté suficientemente enfriada. El aumento de temperatura con respecto a la temperatura ambiente nominal (25 \(^\circ\)C) durante los experimentos de desactivación se resume en la Tabla 2. En todos los casos, el calentamiento de la muestra acumulada se mantiene por debajo de 15 \(^\circ\)C, lo que garantiza ninguna muestra experimental excedería los 40 \(^\circ\)C en todos los casos.

La desactivación de HCoV-229E se estudia en subdivisiones de todo el espectro de frecuencia hasta 40 GHz. Se preparan varias muestras que contienen la misma concentración de HCoV-229E para cada subbanda, de modo que los experimentos puedan repetirse varias veces para mejorar la confianza en los resultados. Las muestras se dividen en grupos experimentales y de control, donde solo se insertan muestras experimentales en la estructura de la guía de ondas y se exponen a un rango de frecuencias. Los detalles del plan de barrido experimental para cada subbanda se proporcionan en la sección de metodología. El análisis de ensayo en placa se utiliza para determinar la concentración viral activa después de la exposición a microondas, que se compara con la muestra de control para establecer la reducción viral relativa. Para todas las bandas, la reducción viral promedio en todas las pruebas se muestra en la Fig. 6, cada una con una barra de error que representa la desviación estándar del conjunto experimental. Estos resultados se resumen en la Tabla 2. Si la reducción promedio es inferior a diez veces en comparación con el control, o si los conjuntos experimental y de control tienen intervalos de desviación estándar superpuestos, se informa "insignificante" en la columna "Reducción viral" en la Tabla 2 para ese experimento. Para todas las bandas, la reducción viral observada se muestra en la Fig. 6 y se resume en la Tabla 2. La reducción viral debe ser estadísticamente significativa y superior a diez veces; de lo contrario, se informa "insignificante" para la banda respectiva.

Inactivación de virus en respuesta a la exposición a microondas.

Los principales hallazgos de este estudio revelan una resonancia intrínseca de HCoV-229E ubicada dentro del régimen de frecuencia de 15,0 a 19,5 GHz. Después de 7,5 minutos de exposición al microondas, se observa una reducción de 3 log en la concentración de virus activo dentro de esta banda. Este nivel de desactivación viral es comparable al observado en otros estudios SRET, aunque se logra en un período más corto. Además, se observó una reducción de 1 log en la banda adyacente de 12,4 a 15,0 GHz, lo que indica cierta sensibilidad, pero no tan óptima y eficiente cerca de la resonancia. Fuera del rango de 12,4 a 19,5 GHz, no se observó ninguna reducción sustancial y estadísticamente significativa. El mayor calentamiento de la muestra se produjo en el rango de 8,2 a 12,4 GHz, alcanzando 40 \(^\circ\)C durante los experimentos, aunque no se observó una reducción significativa. Este resultado respalda aún más que la reducción viral observada en otras bandas se atribuye al daño estructural debido al efecto SRET en lugar del calentamiento.

A los efectos de la espectroscopia de desactivación viral, las guías de ondas rectangulares son ventajosas en comparación con otras soluciones guiadas (líneas de microcinta, guías de ondas coplanares) y radiantes (antena). En primer lugar, los campos dentro de guías de ondas rectangulares tienen modos de propagación bien definidos. Esto hace que la determinación de los campos eléctricos y la densidad de potencia dentro de la guía de ondas, incluso en presencia de una muestra experimental, sea más precisa. Esto es particularmente útil en casos donde el interés es estudiar la respuesta de desactivación de un patógeno a varias intensidades de campo o densidades de potencia. Además, las guías de ondas rectangulares se pueden ahusar para proporcionar espacio adicional para una integración conveniente de una muestra experimental, como se hizo en este trabajo. Esto alterará la sección transversal de la guía donde se encuentra la muestra, pero no los modos de propagación, por lo que aún se pueden determinar con precisión las densidades de potencia y las intensidades del campo eléctrico. Las líneas de transmisión de placas de circuito impreso, como las líneas microstrip o las guías de ondas coplanares, son más limitadas en términos de espacio disponible y facilidad para integrar una muestra experimental. En estos casos, las muestras experimentales sólo pueden colocarse prácticamente encima del conductor del lado de la señal. Sin embargo, hacerlo es extremadamente ineficiente en términos de exposición al campo de la muestra, ya que los campos están contenidos principalmente dentro del sustrato entre la señal del lado superior y los conductores de tierra del lado reverso. Los sistemas que irradian una muestra de virus mediante antenas comparten la misma facilidad de integración de la muestra que las guías de ondas rectangulares; sin embargo, no son muy adecuados para configuraciones de alta potencia. Si bien el hardware de la antena puede manejar alta potencia, la radiación a estos niveles requiere materiales absorbentes adicionales y blindaje de RF para ejecutarse de manera segura, y está sujeta a regulaciones y restricciones adicionales16,17. Por el contrario, las guías de ondas rectangulares pueden manejar y contener altos niveles de potencia, minimizando los riesgos de exposición a RF para el personal involucrado en la realización de los experimentos.

El desarrollo de sistemas de esterilización basados en microondas, tratamientos clínicos y otras tecnologías de control de transmisión se basan fundamentalmente en el conocimiento de qué frecuencias utilizar y el grado de reducción viral activa que se puede esperar en un tiempo determinado. Se ha demostrado que la metodología de espectroscopia de desactivación viral descrita en este artículo produce esta información para HCoV-229E y también es aplicable para estudiar otras interacciones electromagnéticas con patógenos en el régimen de microondas. Además, la metodología propuesta se puede utilizar para estudiar los efectos de los niveles de potencia incidentes, así como la duración de la exposición, en relación con la reducción del virus SRET, que se sabe que tienen influencia2. En general, la exposición de una muestra de virus a microondas provoca además cierto grado de calentamiento. a vibraciones acústicas inducidas dentro de los viriones. Sin embargo, el control de temperatura integrado de las guías de ondas experimentales brinda la confianza de que la reducción viral observada se atribuye al daño estructural causado por las vibraciones acústicas en lugar del calentamiento excesivo. En términos de control de la transmisión de patógenos, el calentamiento puede resultar indeseable. En entornos de esterilización, muchos materiales pueden degradarse o dañarse si se calientan durante períodos prolongados o a temperaturas relativamente altas. Las tecnologías de microondas de baja potencia son prometedoras para estos entornos, ya que es posible una reducción significativa de virus activos manteniendo niveles seguros de calentamiento.

En este informe se presenta una metodología novedosa para estudiar la inactivación funcional de virus en respuesta a campos electromagnéticos. La metodología propuesta se demostró estudiando 229E en el espectro de microondas e identificando regímenes con una reducción clara y significativa de la infectividad viral. Como se describe en nuestra sección "Discusión", esta información se puede utilizar para desarrollar y optimizar la tecnología de control de transmisión dirigida a virus esféricos similares. Se necesitarían más estudios más allá del alcance de este trabajo para confirmar los mecanismos precisos del daño de la estructura del virus en respuesta a los campos electromagnéticos.

La guía de ondas enfriada por aire fue diseñada para imprimirse en 3D a partir de PLA y metalizarse con cinta de papel de aluminio. Esta metodología de diseño se ha probado previamente en 12,13,18 y permite la creación rápida de prototipos de componentes de guías de ondas. Cada guía de ondas se imprimió en cuatro secciones, lo que permitió aplicar la cinta de aluminio a una superficie plana para reducir las arrugas. Las secciones de la guía de ondas se ranuraron y atornillaron entre sí. Cada una de las guías de ondas fue alimentada por lanzadores de guías de ondas estándar disponibles en el mercado y fueron cónicas para adaptarse al tamaño del tubo de muestra viral. Para enfriar las muestras, se cortaron agujeros en los lados de la guía de ondas y se rellenaron con una rejilla. Esta rejilla permitía que el aire pasara a través de la guía de ondas, pero contenía la potencia de RF dentro de la guía. Para cada guía de ondas, se imprimieron como una pieza separada y se metalizaron en el lado de la guía de ondas con cinta de aluminio y en el exterior con una pintura conductora a base de cobre (MG-Chemicals 843WB) para aumentar el aislamiento. Cada guía de ondas tenía cuatro de estas rejillas; dos tenían ventiladores axiales para forzar el ingreso de aire a la guía de ondas, y los otros dos actuaban como puertos de salida con conductos para dirigir el aire caliente lejos de la entrada del ventilador. Finalmente, cada guía de ondas incluía una ubicación para el tubo de muestra. Este era un agujero en el costado de la guía de ondas que encajaba perfectamente en el tubo de ensayo y estaba metalizado y tenía una tapa protectora metalizada que en conjunto contenía la energía de RF en la guía de ondas.

Se utiliza un generador de señales (Anritsu MG3694A) para generar tonos de microondas en las frecuencias deseadas. Las etapas de amplificación de potencia se utilizan para aumentar la potencia de los tonos del generador de señal de modo que se entreguen 2 W de potencia a la entrada de la guía de ondas experimental. Se requirieron múltiples configuraciones de aplicaciones de energía para cubrir el amplio espectro estudiado. En el rango de 0,8 a 8,2 GHz, se utilizan cinco amplificadores de paquete (Analog Devices HMC659LC5): uno en serie y cuatro en paralelo, que se combinan para alcanzar el nivel de potencia objetivo. En los rangos de 8,2 a 19,5 GHz y de 20 a 40 GHz, se utiliza un único amplificador empaquetado (minicircuitos ZVE-3W-183+ y Qorvo QPA2640D, respectivamente) para la amplificación de potencia. La respuesta de potencia de todas las etapas de amplificación se caracteriza barriendo la potencia incidente del generador de señal y midiendo la potencia de salida en un analizador de espectro (Anritsu E4446A). Este procedimiento se repite en cada frecuencia utilizada en el plan de barrido de desactivación de virus experimental. Posteriormente, los datos de caracterización de la amplificación de potencia se guardan en la memoria de un sistema integrado de asistencia digital que interactúa con el generador de señales. Este sistema corrige las variaciones de frecuencia intrínsecas dentro de cada etapa de amplificación de potencia ajustando la potencia del generador de señal incidente de modo que la potencia de salida sea precisamente de 2 W (33 dBm) en todas las frecuencias.

El espectro de 0,8 a 40 GHz investigado se discretiza en 10 subbandas según el rango de frecuencia admitido por cada designación de guía de ondas utilizada, que se resumen en la Tabla 2. El rango experimental de 0,8 a 40 GHz se seleccionó para incluir y rodear a los de 2, 3 donde se observaron resonancias para virus comparables. Se utilizaron múltiples guías de ondas para cubrir esta banda de modo que cada prueba pudiera realizarse en la frecuencia fundamental de la guía de ondas. Era crucial operar en la frecuencia fundamental de la guía de ondas para que el campo máximo estuviera en el centro de cada muestra viral. Cada subbanda utiliza un plan de barrido de microondas idéntico, que consta de 10 tonos discretos equiespaciados dentro de su banda respectiva. La etapa de generación y amplificación de microondas produce cada tono con una potencia incidente de 2W en la guía de ondas durante 45 segundos, en orden ascendente, para un tiempo de barrido total de 7,5 minutos. El tiempo total de barrido se seleccionó para que fuera comparable al in2 en el que se observó una reducción viral significativa. Se preparan muestras de virus vivos en concentraciones iguales y se dividen en grupos experimentales y de control. Ambos grupos, control y experimental, contienen cada uno tres muestras para que cada experimento (subbanda) pueda repetirse tres veces para analizar la repetibilidad y la reducción promedio del virus. Todas las muestras se almacenan en un baño de hielo durante la duración de los experimentos. Las muestras experimentales se retiran temporalmente del baño de hielo y se insertan en la guía de ondas, que luego se exponen a campos de microondas en propagación de acuerdo con el plan de barrido descrito. Las muestras de control no reciben exposición a microondas. Para cada subbanda, el experimento se repite durante tres ensayos. El análisis de ensayo en placa se utiliza para determinar la reducción promedio del virus activo de las muestras experimentales en relación con las muestras de control.

El calentamiento del medio de suero reducido (OptiMEM) se caracteriza para determinar la cantidad de calentamiento del virus durante los experimentos de desactivación del virus. Se prepara una muestra que contiene un volumen igual del medio utilizado en los ensayos experimentales. En primer lugar, se mide la temperatura de la muestra para determinar la temperatura ambiente. Posteriormente, la muestra se inserta en la configuración experimental donde se ejecuta el plan de barrido de desactivación del virus, exponiendo la muestra a microondas dentro de las guías de ondas. Al finalizar el plan de barrido, se mide inmediatamente la temperatura de la muestra para caracterizar cualquier calentamiento debido a la exposición a las microondas. Este procedimiento se repite para cada subbanda incluida en este estudio para verificar que el calentamiento de la muestra sea suficientemente bajo y no contribuya a la desactivación del virus en todos los casos.

El método de sonda coaxial de extremo abierto se utiliza para medir la permitividad compleja del medio de suero reducido. Se utiliza un analizador de redes vectoriales (Anritsu MS4644B) para medir los reflejos de las puntas de las sondas. Las sondas dieléctricas se calibran mediante mediciones estándar de agua abierta, corta y desionizada. El medio con suero reducido se transfiere a un vaso de precipitados limpio de 50 mm de diámetro para preparar una muestra del líquido suficientemente grande y uniforme. Las puntas de las sondas se sumergen en el medio a una profundidad de 10 mm y se miden con el analizador de redes vectoriales. Luego, la información de permitividad compleja (constante dieléctrica, tangente de pérdida) se calcula sobre la frecuencia utilizando las mediciones de calibración. Se genera un modelo empírico utilizando las mediciones de permitividad con una metodología previamente desarrollada14. Este modelo tiene en cuenta la variación de frecuencia de las propiedades EM del medio, lo que mejora significativamente la precisión de la simulación.

HCoV-229E se obtuvo de BEI Resources (NR-52726) y se propagó como se describió anteriormente19. Las reservas de HCoV-229E se valoraron mediante un ensayo de colocación en placas estándar en células Huh719. Las células Huh7 (JCRB0403) se obtuvieron de la Colección Japonesa de Banco de Células de Biorecursos de Investigación. Las células se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) con FBS al 10 %, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 \mu g/ml a 37 °C en CO2 al 5 %.

HCoV-229E se diluyó a 1 x \(10^6\) unidades formadoras de placa (PFU)/ml en OptiMEM (ThermoFisher Scientific, 31985062). Se distribuyeron alícuotas (1 ml) del virus diluido en tubos con tapa de rosca de 1,5 ml (Fisher Scientific 02-681-372) y se sometieron a los diversos tratamientos con microondas descritos. Posteriormente, se evaluó la infectividad viral mediante un ensayo de colocación en placa. Las células Huh7 sembradas el día anterior en placas de 12 pocillos a una densidad de 3,5 x \(10^5\) células/pocillo se infectaron con muestras de HCoV-229E diluidas en serie durante 2 horas a 37 \(^\circ\)C. Después de retirar el inóculo, las monocapas celulares se cubrieron con carboximetilcelulosa al 1,2 % en DMEM que contenía FBS al 2 % y se incubaron a 33 \(^\circ\)C en CO2 al 5 % hasta 4 días después de la infección. Las células se fijaron y se tiñeron con una solución de tinción de cristal violeta (1% de cristal violeta en 17% de metanol en H2O) para permitir la visualización de las placas. Se contaron las placas para determinar el título viral.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo cuenta con el apoyo del Gobierno de Canadá, Departamento de Defensa Nacional, Innovación para la Excelencia en Defensa y la Seguridad (IDEaS).

Los experimentos con virus contaron con financiación del Consejo de Investigación en Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá (CCC) y una Beca de Iniciación a la Investigación de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Queen (CCC).

Ingeniería Eléctrica e Informática, Queen's University, Kingston, K7L 3N6, Canadá

Hayden Banting, Ian Goode y Carlos E. Saavedra

Ciencias Biomédicas y Moleculares, Queen's University, Kingston, K7L 3N6, Canadá

Carla E. Gallardo Flores & Che C. Colpitts

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Los autores IG, HB y CS concibieron los experimentos. Los autores IG y HB desarrollaron el hardware y los sistemas experimentales y ejecutaron los experimentos. Los autores CEF y CCC realizaron ensayos de placa y analizaron todos los resultados experimentales. Todos los autores contribuyeron y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Hayden Banting.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Banting, H., Goode, I., Flores, CEG et al. Espectroscopia de desactivación electromagnética del coronavirus humano 229E. Representante científico 13, 8886 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36030-6

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Recibido: 09 de marzo de 2023

Aceptado: 27 de mayo de 2023

Publicado: 01 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36030-6

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